تکنیک FISH

مقدمه
سیتوژنیک در بردارنده ی مطالعه ی ساختارهای سلولی با تمرکز بیشتر بر روی تغییرات تعدادی و ساختاری کروموزوم ها می باشد.
آغاز مطالعات سیتوژنیک به دهه ی 1950 باز می گرددونخستین بار توسط این دانش مشخص گشت که ژنوم انسان شامل 46 عددکروموزوم است.
مطالعات سیتوژنیک به روش های سنتی و مدرن تقسیم می شوند.
روش سنتی:1-کاریوتایپینگ 2-فلیستومتری
روش مدرن:1-دورگه سازی فلوئورسانت درجا((FISH
2-دورگه سازی ژنومی مقا یسه ای CGH))
تکنیک هیبریداسیون در محل به وسیلهPardue,Gall,jone و همکاران انها در سال 1969 ایجاد شد .FISH((fluorescence in situ hybridizationدر واقع هیبریدسازی فلوئورسنت درجا یکی از متدهای هیبریدیزاسیون یا همان دورگه سازی است.
سه نوع هیبریدیزاسیون وجود دارد:
1-ساترن بلاتینگ شناسا یی توالی های DNAیاکروموزوم توسط قطعاتDNAشناخته شده یا سنتز شده می باشدکه پروب نامیده می شود.
2-نورتن بلاتینگ:شناسایی توالی RNAتوسط پروب
3-وسترن بلاتینگ:شناسایی پروتئین ها توسط آنتی بادی های منو کلونال وپلی کلونال که به صورت کاملا اختصاصی است.این روش از روش های تاییدی برایHIVاست.
FISHجز روش های ساترن بلاتینگ است که با کمک پروب های اختصاصی از جنس DNAکه متصل به مواد فلوئورسنت است قطعات DNAمربوط به باکتری هاوویروس ها ویا حتی قسمت هایی از از کروموزوم و...شناسایی می کند.
این تکنیک یک تکنولوژی 20 ساله است وبه صورت مداوم توسعه یافته است. با اینکه اصول اساسی این تکنیک تغییری نکرده است اما با مشاهدات وآزمایشاتی می تدان نتیجه گرفت که نسبت به گذشته پیشرفت کرده است و از تکنولوژی های قدیمی تر جلو زده است تبدیل به یک ازمایش بیولوژیکی جدید شده است.محبوبیت این تکنیک به دلیل تنوع گسترده وکاربرد ان و سهولت تقریبی انجام آن است.

در این تکنیک توالی های DNA که از قبل مکان یابی شده اند در ابتدا برای ایجاد، کاوشگربا مواد فلوئورسنت نشاندار می شود سپس کاوشگر با کروموزوم های معینی در بافر هیبریداسیون ترکیب می شود.پس از دناتوره شدن و تیمار،DNA به رشته های مجزا و کاوشگر ومحل از قبل معین شده برای اتصال مجددآماده می شوند.کاوشگر اختصاصی عمل می کندو با مکان مکمل خود بر روی کروموزوم باند می شود .پس از شست وشو دادن و شناسایی توسط گزارشگر فلوئورسنت،سیگنال فلوئورسنت که در محل هیبریدکاوشگر است،به طور مجزا دیده می شود و تشخیص بر عهده میکروسکوپ اپی فلوئورسنت است .در واقع می توان گفت هیبریداسیون در محل،یک تکنیک بسیار حساس است که برای تشخیص فعالیت ژن ها به صورت مستقیم در بافت ها یا سلول ها تثبیت شده است.تثبیت شدن سلول،بافت وبا حتی جنین بافرمامید انجام می شود.باید اشاره کرد که تثبیت به این دلیل انجام می شود که از شکسته شدن مولکول جلوگیری شودتا مولکول ها برای آنالیز در محل موردنظر باقی بمانند.
مراحل این تکنبک به اختصار شامل 5 مورد است :
1-نمونه ها را روی اسلاید ها ثابت می کنیم .
2-اولیگونوکلئوتیدهایی که به فلوئورسنت آغشته هستند را هیبرید می کنیم.
3-رنگ آمیزی با رنگ هایی که اختصاصی عمل نمی کنند انجام می شود مانند PAPI
4-مواد شست و شو دهنده نیز لازم است .
5-ودراخرمشاهده زیر میکروسکوپ اپی فلوئورسنت
از کاوشگرهای اسید نوکلوئیکی که توسط رنگ های فلوئورسنت نشانه گذاری شده اند برای تشخیص توالی های بزرگ استفاده می شود.این روش زمان کمی نیاز دارداما شدت سیگنال هایی که ایجاد می شودکم است.
اگر بخواهیم شدت سیگنال و حساسیت آن ها را بالا ببریم می توانیم از لایه های معرف شیمیایی شناساگر استفاده کنیم .بااستفاده از ابزار های نام برده شده می توان توالی های تک نسخه ای رو کروموزوم های دارای کاوشگر های کوتاه تر از 8/0 کیلو باز را شناسایی کرد .طول این کاوشگر ها حدود چندین جفت باز(اولیگنوکلوئتید)تا بیشتر از یک مگا باز باشند.
انواع مختلفی کاوشگر وجود دارد که برای شناسایی انواع مشخصی ازDNAاستفاده می شود.توالی های تکراریDNA که به دلیل pcrتکثیر یافته،اولیگونوکلوئوتید های اختصاصی برای عناصرتکراری یا تکراری کلون شده برای شناسایی دسته هایی ازDNAتکراری که در نواحی هترو کروماتینی یا نواحی سنترو مری کروموزوم ها ی محزا هستند،مورد استفاده قرار می گیرند ویا بالعکس برای شناسایی توالی های هدف تک لوکوسی،DNA ها یا قطعه های از DNA ژنومی کلون شده با اندازه ای بین 100کیلو باز تا 1 مگا باز به کار می رود و همچنین برای شناسایی کروموزوم های خاص یا نواحی کروی از CDNA هاي خاص هر كروموزوم به عنوان كاوشگر به منظور تشخیص کروموزوم های مجزا از مجموعه کامل کروموزومی استفاده می شود.
حال می خواهیم ازشرایط لازم برای انجام هیبریداسیون موفق صحبت کنیم:
1-طول کاوشگر:اگر طول کوتاه باشد احتمال هیبرید شدن با مکان هایی غیر این مورد نظر اتفاق می افتداگر طول ان بلند باشد،سبب افزایش زمان مورد نظر برای هیبریداسیون می گردد.
2-درجه حرارت:برای دناتوره شدن دمای 94 درجه سانتی گراد مناسب است وبرای هیبریداسیون بسته به درجه حرارت ذوب و شدت آن دارد.بايد توجه كنيم كه دماي بسيار پايين باعث وقوع هيبريدهاي ناهماهنگ ميشود و در دماي بسيار بالا هم كلا هيبريداسيون رخ نميدهد
3-غلظت نمک و PH و فرمامید:نیز باید مناسب باشد.

تغییرات و مزایای FISH:
مشکلات زیر در هیبریداسیون ایزوتوپیک سبب ایجاد تکنیک های جدیدمانند FISH بود:
1-کاوشگر های رادیواکتیو هزینه زیادی را دربرمی گیرندوهمچنین نبایدغافل شد که مواد رادیواکتیو خطرناک اند.
2-برای اینکه سیگنال های قابل اندازه گیری روی فیلم را دیوگرافی تولید شود زمان های طولانی مدتی برای تماس مورد نیاز است.
3-بااینکه حساسیت روش اتورادیوگرافی بالااست و این نکته ای مثبت است اما وضوح این روش پایین است.
4- مواد رادیواکتیو که برای کاوشگر ها استفاده می شودناپایدار است به همین دلیل ایزوتوپ ها به مرور از بین می رفتندوبه همین علت فعالیت اختصاصی کاوشگر ها به دصورت ثابت باقی نمی ماند.
بنابراینFISH امکان پیشرفت های زیادرا در زمینه وضوح سرعت و امنیت ایجاد کرده است و همچنین با این تکنیک پیشرفته تر می توان بطور همزمان شناسایی مولکول های هدف چندتایی ،آنالیز های کمی ووتصویر برداری های زنده سلولی را انجام داد.اهداف جديد باعث ايجاد اين پيشرفت هاي بزرگ شد و همچنين باعث محبوبيت بيشتر اين ازمايش در دهه ١٩٩٠شد.

یکی از تغییرات مهمی که در سال 1992 در تکنیک هیبریداسیون در محل توسط schwaracherو همکارانش برای گیاهان ایجاد شد تکنیک GISH بود.
از این تکنیک برای جداکردن کروموزوم های ژنوم های والدی مختلف در گونه های پلوئید،هیبرید های بین گونه ای و نتایج حاصل از بک کراس آن ها وردیابی بین ژنومی جابه جایی کروموزوم ها استفاده می شود ونیز اطلاعاتی درباره ی منشا ترکیب ژنوم و جابه جایی بین ژنومی به ما می دهد.کاربرد این تکنیک برای گیاهان هیبرید،تعیین منشا ژنوم کروموزوم های جفت شده و کروموزوم های جفت نشده را در ارایش متافازی نشان می دهد.
تکنیک GISHیک تکنیک رنگ امیزی ژنومی است وژنوم های مادری هیبرید های بین گونه ای را تشخیص می دهند.کل DNA ژنومی یک والد نشان دار می شودونقش کاوشگر را ایفا می کند و کلDNAژنومی والد دیگر غیرنشان دار باقی می ماند ونقش یک block (قالب)را برعهده می گیرد ویا کل DNA ژنومی هر دو والد،به عنوان کاوشگر استفاده می شودوسپس هرکدام توسط رنگ های فلوئورسنتی گوناگون شناسایی می شوند. این تکنیک بر اساس تکامل سریع در گونه زایی توالی های تکراری می باشدو بخش زیادی از DNA گیاه را مشخص مي كند.
اگر فاصله گونه ها ازهم به میزان قابل توجهی باشدتوالی های تکراری باعث تمایز کروموزوم های ناشی از2گونه والدی می شوند.
در اخر میخواهیم به طور کاملا خلاصه کاربرد های FISH را بيان كنيم :
FISHدر پزشکی :
1-تشخیص سریع قبل از تولد ناهنجاری های کروموزومی (تکنیک RapidFISH)
2-تشخیص انواع سرطان ها
3-تشخیص بعداز تولد
4-تشخیص قبل از لانه گزینی(PGO)
کاربرد تکنیک FISH
1-اولین کاربرد آن در سال 1980اتفاق افتاد RNAاز انتهای 3به صورت مستقیم با موادفلوئورسنت نشان دار شد وبه عنوان کاوشگر برای توالی های خاص استفاده شد.
2-آنالیز ساختمانی ژنوم را انجام میدهد.
3-سطح پلوئیدی را معین میکند.
4-یک ناحیه از DNAیا RNA را تشخیص می دهد.
5-فعالیت ژن هارا تشخیص می دهدوبرای تهیه ی نقشه های ژنی کمک می کند.
6-غلظت بالای جفت باز هارا تشخیص می دهد.
در پایان می توان گفت که این تکنیک،تکنیک پیشرفته و محبوبی است و پیشرفت های زیادی تاکنون داشته است.همچنین در اینده احتمال اینکه این تکنیک اثرقابل توجهی در تصویربرداری از یاخته های زنده و تشخیص های درمانی خواهد گذاشت و امیدواریم که این تکنیک به موفقیت های روز افزونی دست پیدا کند.

شرکت فن اوران هیستوژنوتک پارس بر ان است تا پس از معرفی مختصری از انواع تست های ژنتیکی بر اساس هدف کاربردی ان ها به معرفی فرایندها،کاربردها و معایب و مزایای برخی از پرکاربرد ترین تست های ژنیکی در دوحوزه سیتوژنیکی به معرفی تست های دستکاری ژنتیکی،فلوسیتومتری،CGH،FISHودر حوزه ژنتیک مولکولی به انواع روش های مبتنی بر PCR،کمی سازیPCR
وتکنیک های نسل جدید توالی یابی NGSمی شود .
از اقدامات شرکت فن اوران هیستوژنوتک پارس به موارد زیر می توان اشاره نمود:
-ترانسفورماسیون باکتری با وکتورباروش شیمیا یی والکتروپوریشن
-کشت کلونی باکتری،تخلیص پلاسمید،ایجاد ویروس از وکتور
-ترانسداکشن سلول با ویروس
-ترانسفکشن سلول با وکتورGFP
-تولید رده سلول های نوترکیب
-انجام تکنیک الایزا ،وسترن بلات و فلوسیتومتری
-طراحی وکتور های بیا نی
-طراحی ،سفارش و بررسی صحت ساخت وکتور
-کارگاه اموزشی کلونینگ ژن با پروتئین
منابع
BaumanG,wiegantj,Borst p,van
A new method for flurescence microscopial
Localization of specific DNA squences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA
FROZAN F,KAVHU R,KONONEN F ,...u2003

برچسبها: بیوکمپ_تکنیک های سیتوژنیک_تکنیک FISH_شرکت فن آوران

+ نوشته شده توسط microbiologists در سه شنبه ۲۰ تیر ۱۳۹۶ و ساعت 3:52 |